克隆知识

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克隆是英文"clone"或"cloning"的音译，而英文"clone"则起源于希腊文"Klone"，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如杆插和嫁接。 如今，克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。 时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆羊多利也是克隆的产物。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。 关于克隆的设想，我国明代的大作家吴承恩已有精彩的描述——孙悟空经常在紧要关头拔一把猴毛变出一大群猴子，猴毛变猴就是克隆猴。

是英文“clone”一词的音译，在大陆译为“无性繁殖”在台湾与港澳一般意译为复制或转殖，是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程.科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。

另外一种克隆方法是提取两个或多个人的基因细胞进行组合形成胚胎,出生后的克隆人将有提供基因的几个人的特征.就像游戏(终极刺客代号47)里面的克隆人47\17号一样,主角杀手47是一个克隆人.他的基因来源于五个人的组合在一起.

先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。

克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。

克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。

同一克隆的所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。

目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。

采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。

从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。 1964年，英国科学家格登（J.Gurdon)将非洲爪蟾未受精的卵用紫外线照射，破坏其细胞核，然后从蝌蚪的体细胞——场上皮细胞中吸取细胞核，并将该核注入核被破坏的卵中，结果发现有1.5%这种移核卵分化发育成为正常的成蛙。格登的试验第一次证明了动物的体细胞核具有全面性。

哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。

克隆羊“多莉”的意义和引起的反响

以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。

在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。

克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。

1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。

此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。

2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。

在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。

克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：

（1）培育优良畜种和生产实验动物；

（2）生产转基因动物；

（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；

（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。

以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。

转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。

体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。

胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。

克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。

作为一个新兴的研究队 在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。

此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。

即使是正常发育的“多利”，也被发现有早衰迹象。染色体的末端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。

除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。

一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗……凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖，无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”。

自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体，这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这两个、四个、八个……个体就叫做无性繁殖系（也叫克隆）。

1979年春，中国科学院武汉水生生物研究所的科学家用鲫鱼囊胚期的细胞进行人工培养，经过385天59代连续传代培养后，用直径10微米左右的玻璃管在显微镜下从培养细胞中吸出细胞核，在此同时，除去鲫鱼卵细胞的核，让卵细胞留出空间作好接纳囊胚细胞核的准备，一切准备就绪后，把玻璃管吸出的核移放到空出位置的鲫鱼卵细胞内，得到了囊胚细胞核的卵细胞在人工培养下大部分夭亡了，在189个这种换核卵细胞中，只有两个孵化出了鱼苗，而最终只有一条幼鱼度过难关，经过80多天培养后长成8厘米长的鲫鱼。这种鲫鱼并没有经过雌、雄细胞的结合，仅仅是给卵细胞换了个囊胚细胞的核，实际上是由换核卵产生的，因此也是克隆鱼。

在克隆鲫鱼出现之前，英国牛津大学的科学家已经在1960年和1962年，先后用非洲一种有爪的蟾蜍（非洲爪蟾）进行过克隆试验。试验方式是先用紫外线照射爪蟾卵细胞，破坏其中的核，然后依靠高超的外科手术从爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞、肝细胞、肾细胞中取出核，并把这些细胞的核精确地放进已被紫外线破坏了细胞核的卵细胞内，经过精心照料，这些换核卵中终于有一部分长出了活蹦乱跳的爪蟾，这种爪蟾也不是经过精细胞和卵细胞州结合产生的，所以也是克隆爪蟾。

我国著名生物学家童第周先生在1978年成功地进行了黑斑蛙的克隆试验，他将黑斑蛙的红细胞的核移人事先除去了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵最后长成能在水中自由游泳的蝌蚪。

鱼类换核技术的成熟和两栖类换核的成功，使一批从事良种培育工作的科学家激动不已，既然鲫鱼的囊胚细胞核取代鲫鱼卵细胞核后能得到克隆鱼，那么异种鱼换核能否得到新的杂种鱼呢？我国科学家首先提出了这个问题，也首先解决了这个问题，就是培养克隆鲫鱼成功的那个研究所，设法把鲤鱼胚胎细胞的核取代了鲫鱼卵细胞的核。鲤鱼细胞核和鲫鱼卵细胞质居然能相安无事，并开始了类似受精卵分裂发育的过程，最后长出有“胡须”的“鲤鲫鱼”，这种鱼有“胡须”，生长快，完全像鲤鱼，但它的侧线鳞片数和脊椎骨的数目与鲫鱼相同，而且鱼味鲜美不亚于鲫鱼。这种人工克隆新鱼种的出现为鱼类育种开辟了新途径。

对科学的追求是永无止境的，鱼类，两栖类克隆的成功自然而然地使科学家把目光投向了哺乳类。美国和瑞士的科学家率先从灰色小鼠的胚胎细胞中取出细胞核，用这个核取代黑色小鼠受精卵细胞核。实际上，这个黑色小鼠的受精卵在精细胞核刚进入卵细胞后，就把精细胞核连同卵细胞的核一起除去。灰鼠胚胎细胞的核移人黑色小鼠的去核受精卵后，在试管里人工培养了四天，然后再把它植人白色小鼠的子宫内、经几百次灰、黑、白这样的操作以后，白色小鼠终于生下了三只小灰鼠。

1996年2月27日出版的英国“自然”杂志公布了爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经过247次失败之后，他们在前年7月得到了一只名为“多利”的克隆雌性绵羊。

“多莉”绵羊是如何“创造”出来的呢？威尔莫特等学者先给“苏格兰黑面羊”注射促性腺素，促使它排卵，得到卵之后，立即用极细的吸管从卵细胞中取出核，与此同时，从怀孕三个月的“芬多席特”六龄母羊的乳腺细胞中取出核，立即送人取走核的“苏格兰黑面羊”的卵细胞中，手术完成之后，用相同频率的电脉冲刺激换核卵，让“苏格兰黑面羊”的卵细胞质与“芬多席特”母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在试管里经历受精卵那样的分裂、发育而形成胚胎的过程，然后，将胚胎巧妙地植人另一只母羊的子宫里。到去年7月，这只“护理”体外形成胚胎的母羊终于产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是“换核卵”一步一步发展的结果，因此是“克隆羊”。

“克隆羊”的诞生，在世界各国引起了震惊，它难能可贵之处在于换进去的是体细胞的核，而不是胚胎细胞核。这个结果证明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。也就是说，动物细胞与植物细胞一样，也具有全能性。

克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。

母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。

克隆动物还对于研究癌生物学、研究免疫学、研究人的寿命等都有不可低估的作用。

不可否认，“克隆绵羊”的问世也引起了许多人对“克隆人”的兴趣，例如，有人在考虑，是否可用自己的细胞克隆成一个胚胎，在其成形前就冰冻起来。在将来的某一天，自身的某个器官出了问题时，就可从胚胎中取出这个器官进行培养，然后替换自己病变的器官，这也就是用克隆法为人类自身提供“配件”。

有关“克隆人”的讨论提醒人们，科技进步是一首悲喜交集的进行曲。科技越发展，对社会的渗透越广泛深入，就越有可能引起许多有关的伦理、道德和法律等问题。我想用诺贝尔奖获得者，著名分子生物学家J.D.沃森的话来结束本文：“可以期待，许多生物学家，特别是那些从事无性繁殖研究的科学家，将会严肃地考虑它的含意，并展开科学讨论，用以教育世界人民。”

1．克隆技术与遗传育种

在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。

2．克隆技术与濒危生物保护

克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。

3．克隆技术与医学

在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？

克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

4．生长周期短，遗传性状稳定

根癌农杆菌介导转化

变态根（modified root）由于功能改变引起的形态和结构都发生变化的根。根变态是一种可以稳定遗传的变异。主根、侧根和不定根都可以发生变态。

在形态、结构和生理功能发生了显著变化的根称为变态根。变态根是植物体在长期进化发展过程中形成的变态，是适应环境的结果。这种变态的特性形成之后，一代代的遗传下来，成为遗传性状。

（1）支持根：像玉米从节上生出一些不定根，表皮往往角质化，厚壁组织发达，不定根伸入土中，继续产生侧根，成为增强植物体支持力量的辅助根系。另像榕树从枝上产生多数下垂的气生根，部分气生根也伸进土壤，由于以后的次生生长，成为粗大的木质支持根，树冠扩展的大榕树能呈“一树成林”的壮观。还有甘蔗等植物也属这类型的根。?

（2）板根：板根常见于热带树种中，如香龙眼、臭楝、漆树科和红树科中的一些种类。板根是在特定的环境下，主根发育不良，侧根向上侧隆起生长，与树干基部相接部位形成发达的木质板状隆脊。有的板根可达数米，增强了对巨大树冠的支持力量。?

（3）攀援根：像常春藤、络石、凌霄等植物的茎细长柔弱，不能直立，生出不定根。这些根顶端扁平，有的成为吸盘状，以固着在其他树干、石山或墙壁表面，而攀援上升，有攀援吸附作用，故称攀援根。?

（4）附生根：在热带森林中，像兰科、天南星科植物生有附生根。附贴在木本植物的树皮上，并从树皮缝隙内吸收蓄存的水分，这种根的外表形成根被，由多层厚壁死细胞组成，可以贮存雨水、露水供内部组织用，干旱时根被失水而为空气所充满。附生根内部的细胞往往含有叶绿素，有一定的光合作用能力。?

（5）呼吸根：分布于沼泽地区或海岸低处的一些植物；例如水龙、红树、落羽松等。在它们的根系中，有一部分根向上生长，露出地面，成为呼吸根。呼吸根外有呼吸孔，内有发达的通气组织，有利于通气和贮存气体，以适应土壤中缺气的情况，维持植物的正常生活。还有海桑、水龙等植物。

根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，AT-MT）。根癌农杆菌（Agrobacterium tumeficiens）能够在受伤部位侵染植物，将其Ti质粒上的T-DNA（transfer DNA）转入植物细胞并整合进植物的基因组。根据农杆菌的这一特点根癌农杆菌介导植物细胞的转化已发展成为一种常用的遗传转化方法。除了转化植物细胞以外，ATMT对酵母、丝状真菌、动物细胞均实现了成功的转化。对丝状真菌转化来讲，传统的丝状真菌转化方法需制备原生质体，而ATMT对丝状真菌的转化可以孢子、菌丝等直接作为转化受体，操作更为简便。因此，ATMT在丝状真菌的转化中的应用日益广泛，并也被应用在对木霉菌的遗传转化中，已经成为最常用的转化真菌木霉的转化方法之一。

8.1.5.1 根癌农杆菌介导转化原理

根癌农杆菌介导木霉等真菌的转化原理同对植物的转化原理基本是一致的。已有研究表明，根癌农杆菌介导木霉等丝状真菌的遗传转化同样需要vir基因的表达。目前，对根癌农杆菌介导转化中参与外源基因转移的相关基因的转录和调控机理已研究得相当深入。其中，农杆菌Ti质粒上毒性基因vir的表达是完成遗传转化所必需的。在一些酚类化合物的作用下，例如乙酰丁香酮，诱导Ti质粒上vir基因的表达，合成T-DNA转移所需的一些蛋白质。它们编码的蛋白质产物参与单链T-DNA的合成、加工和转移等过程。

其中，VirA与VirG为调节蛋白，呈低水平的组成型表达，当外界存在酚类化合物例如乙酰丁香酮等诱导物时，可以激活由vir产生的VirA和VirG组成的双重调控系统。在特定单糖存在的情况下，染色体基因表达的蛋白质ChvE与VirA相互作用进一步增强了vir基因的表达水平。VirA是一种膜镶嵌蛋白，在乙酰丁香酮的作用下，能够自动磷酸化，活化后的VirG是一种DNA结合蛋白，作为转录激活因子，能进一步激活本身基因和vir区其他基因的表达。

T-DNA以单链的形式转入受体细胞，因此，首先是单链T-DNA的合成及加工，VirD编码的产物VirD1和VirD2参与其中。在VirD1协助下VirD2可与T-DNA两侧的边界重复序列的特定位点结合并切割产生缺口，止于左侧边界重复序列。在靠近右边界重复序列有一个25bp的强驱动序列，VirC1蛋白结合在这个地方，也刺激了T-DNA 单链的产生。随后，在DNA聚合酶的作用下，于缺口处进行单链T-DNA的复制，当复制进行到另一缺口时，T-DNA释放并与VirD2结合为VirD2/T-DNA复合体。

单链形成以后，T-DNA就会通过Ⅳ型的分泌机制，穿过细菌的细胞膜和细胞壁，VirB和VirD4蛋白参与了这个过程。VirB编码产物在细菌的表面形成转运孔道和T-pilus的结构。virD编码产物VirD4为膜嵌蛋白，介导VirD2/T-DNA复合体和VirB蛋白复合体的相互作用。VirD2/T-DNA组成的复合体及VirE2和VirE3通过IV型分泌机制转出细菌。

目前，对单链T-DNA复合物进入受体细胞的机制尚不清楚，但对由受体细胞质向细胞核的转移机制已有了一些初步的认识，VirD2和VirE3在其中发挥关键作用，这两种蛋白引导T-DNA进入受体细胞核，其中，VirD2含有核定位信号序列NLS，可以与宿主细胞的A核周蛋白（karypherin）发生作用而被转移到细胞核。同时，VirE3还可以与受体细胞中的A核周蛋白结合而通过依赖于A核周蛋白的途径被转运到受体细胞核中，从而引导T-DNA复合物进入细胞核。一旦进入细胞核内，T-DNA能稳定地整合到基因组中。T-DNA整合的具体机制现在还不很清楚，但宿主的蛋白质应起了重要的作用（Caroline et al.，2005）。

8.1.5.2 根癌农杆菌介导转化的步骤

（1）双元载体的构建。双元表达载体系统实际上就是一个质粒，双元载体包含两个部分，一个部分是能够被转移的T-DNA，另一个是能够帮助T-DNA转移的Vir区。转移区是有左右边界的，一般将含有合适真菌启动子和终止子的抗性基因插入T-DNA的两个边界序列之间，例如潮霉素B基因（hygromycin B phosphotransferase gene），在转基因时会在左右边界处断裂，只将左右边界以内的T-DNA区域整合到宿主基因组中。双元表达载体可以通过冻融法、三亲交配或电激法转化（大肠杆菌供体菌+大肠杆菌协助菌+根癌农杆菌受体菌），将构建好的质粒载体转入根癌农杆菌。根据目的的不同，构建的双元载体可分为两种类型：随机插入型和靶基因插入型的质粒载体。靶基因插入型的质粒载体要在抗性基因两端连接一段与目的基因序列同源并且长度合适的DNA片段，通过同源重组造成靶基因的突变。为了基因克隆，还可以在边界重复序列之间插入适当的克隆载体，使用质粒拯救和TAIL-PCR等方法从转化子中重新获得T-DNA和目标基因片段。

（2）根癌农杆菌的活化和培养。从YEP平板上挑取含有双元载体的根癌农杆菌单克隆菌落接种于含有合适抗生素的7mL YEP液体培养基中，250r/min，28℃过夜培养。次日，用诱导培养基IM（含200μM乙酰丁香酮）稀释到OD660为0.15，然后继续培养4～6h至OD660为0.6～0.8。

（3）共培养和转化子的筛选、鉴定。将100μL诱导活化的根癌农杆菌和等体积的木霉分生孢子悬液混合后均匀地涂布在含有200μM乙酰丁香酮的IM培养基平板上，28℃条件下培养48h，然后在IM培养基平板上覆盖一层含100μg/mL潮霉素（或其他抗生素）的PDA培养基（含有50μg/mL的四环素以杀死根癌农杆菌）。继续培养4～7d，将长出的转化子挑到含潮霉素培养基上进行筛选培养。将抗性菌转接到含药培养基上继续培养，提取基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交来鉴定疑似转化子及插入T-DNA的拷贝数。

8.1.5.3 影响根癌农杆菌介导遗传转化效率的因素

ATMT相对于其他转化方法，虽然具有转化效率高的特点，但其转化效率也同样受诸多因素的影响。这些因素包括根癌农杆菌菌株类型、转化受体类型、根癌农杆菌与受体的浓度、乙酰丁香酮的浓度和共培养环境条件（时间、温度、pH值）等。

ATMT受体材料来源广泛，不仅可以是原生质体，还可以是孢子、菌丝体及子实体组织等，从而扩大了农杆菌介导真菌转化的范围。但是个别真菌只能转化特定的类型。例如，ATMT对粗球孢子菌（Coccidioides immitis）只有以萌发的孢子作为初始材料才能转化成功，但对根霉菌（Rhizopus oryzae）和毛霉菌（Mucor circinelloides）只有以原生质体为初始材料才可。而对木霉来说，主要用分生孢子和菌丝作为转化的对象。但不同菌株的转化效率差别也是很大的。

常用于转化真菌的农杆菌菌株有AGL-1，EHA105，LBA1100，LBA4404及C58C1等，不同农杆菌菌株对转化效率的影响很大。对同一受体材料来说，不同农杆菌菌株对转化效率影响很大，例如，Kemppainen等（2005）发现对外生菌根生共体Laccaria bicolor来说，根癌农杆菌LBA1100和AGL-1转化效率相差4倍，AGL-1更适用。高兴喜等（2004）用AGL-1和LBA4404对 T.harzianum T88进行遗传转化发现，其中 LBA4404并不能转化T.harzianum T88，而AGL-1转化T.harzianum T88获得成功。综合相关报道可得出具有高Vir毒力的菌株，相对有较高的转化效率，而且不同菌株和载体类型对转化效率的影响还具有互作效应。

乙酰丁香酮（AS）是诱导农杆菌毒性基因表达的基本因素，也是转化成功与否的一个关键因素。AS在根癌农杆菌共培养期间是必需的。共培养前，利用AS对根癌农杆菌进行诱导培养，可以提高转化效率。其中，共培养基中AS的加入与否直接决定转化的成功与否，加入的浓度决定转化效率的高低；诱导过程中不加入AS会导致转化效率的降低。此外，共培养基中AS浓度会影响T-DNA插入的拷贝数，通常浓度过高会增加T-DNA插入拷贝数。如Mullins等（2001）在转化尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的过程中发现随着AS浓度的增加，T-DNA插入拷贝数也增加。

转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度也会影响转化效率。随着受体菌或农杆菌浓度的增加，转化效率会明显提高。但两者作用增长有一定限度，农杆菌过量会造成转化效率降低。而且高浓度的农杆菌共培养之后很难抑制其生长，从而影响转化子的生长。而受体菌浓度过高，会对转化子的挑取造成困难。

此外，共培养的环境条件（培养温度、时间和pH值）对转化效率也有一定的影响，共培养时间太短不能形成转化子，随着共培养时间的延长，转化子数目相应增加，对于木霉来说，由于生长过快，培养时间过长容易造成菌落重叠，不宜于菌落的筛选，一般共培养时间控制在24～48h之内。温度对转化率的影响没有共培养时间显著，温度范围一般为20～37℃，22～25℃为最佳温度。在比较高的温度下（＞28℃），根癌农杆菌不能很好地发挥其功能。共培养基的pH值对转化效率也有明显的影响，一般在pH值为6.0左右时效率较高，增加或降pH值都会使转化效率明显降低，尤其在高pH值条件下，转化效率更低，这可能是由于高pH值对毒性蛋白的表达有不良影响。例如，黄亚丽（2008）考察了共培养的环境条件对T.harzianum转化的影响，发现在一定范围内随着共培养时间的延长、温度的升高其转化效率明显增加。但是，时间过长、温度太高转化效率反而降低。以转化温度24℃为例，在共转化24h时转化效率为14个转化子/107个孢子，36h为200个转化子/107个孢子，48h转化效率最高为275个转化子/107个孢子，而当共转化时间延长到72h时，在共培养平板上木霉菌丝生长的过多，当转到抗性平板后在培养基上出现了大量的背景菌落，可能是因为潮霉素B不能杀死已经过多、过旺生长的木霉菌丝的缘故。共转化温度对转化效率的影响也存在拐点，在温度低时转化效率较低，随着温度的升高转化效率逐步提高，等达到一定温度后，再提高温度，转化效率反而会降低。这可能是因为温度过高或过低都不利于农杆菌毒性蛋白功能的发挥。对于pH值来说，共转化在pH值为5.3的环境中最适，增加或降低pH值都会使转化效率明显降低，当pH值高于6.5之后几乎没有任何转化子产生。

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